Gram Stain Procedure in Microbiology

Gram-fläcken är en differentiell metod för färgning som används för att tilldela bakterier till en av två grupper (gram-positiv och gram-negativ) baserat på egenskaperna hos deras cellväggar. Det är också känt som Gram-färgning eller Grams metod. Förfarandet heter för den person som utvecklade tekniken, den danska bakteriologen Hans Christian Gram.

Hur Gram Stain fungerar

Förfarandet baseras på reaktionen mellan peptidoglykan i cellväggarna hos vissa bakterier. Gram-fläcken involverar färgning av bakterier, fixering av färgen med en mordant, avfärgning av cellerna och applicering av en försänkning.

1. Den primära fläcken (kristallviolett) binder till peptidoglykan, färgcellerna lila. Både gram-positiva och gram-negativa celler har peptidoglykan i sina cellväggar, så från början fläckar alla bakterier violetta.
2. Grams jod (jod och kaliumjodid) appliceras som ett mordant eller fixativ. Grampositiva celler bildar ett kristallviolett-jodkomplex.
3. Alkohol eller aceton används för att färga cellerna. Gramnegativa bakterier har mycket mindre peptidoglykan i sina cellväggar, så detta steg gör dem väsentligen färglösa, medan endast en del av färgen tas bort från gram-positiva celler, som har mer peptidoglykan (60-90% av cellväggen). Den tjocka cellväggen hos gram-positiva celler dehydratiseras genom avfärgningssteget, vilket får dem att krympa och fånga fläck-jodkomplexet inuti.
4. Efter avfärgningssteget appliceras en försänkning (vanligtvis safranin, men ibland fuchsin) för att färga bakterierna rosa. Både gram-positiva och gram-negativa bakterier plockar upp den rosa fläcken, men den är inte synlig över den mörkare lila av de gram-positiva bakterierna. Om färgningsproceduren utförs korrekt kommer grampositiva bakterier att vara lila, medan gramnegativa bakterier blir rosa.

Syfte med Gramfärgningstekniken

Resultaten av Gram-fläcken ses med ljusmikroskopi. Eftersom bakterierna är färgade identifieras inte bara deras Gram-fläckgrupp, utan deras form, storlek och klumpmönster kan observeras. Detta gör Gram-fläcken till ett värdefullt diagnostiskt verktyg för en medicinsk klinik eller laboratorium. Medan fläcken kanske inte identifierar bakterier, räcker det ofta med att veta om de är grampositiva eller gramnegativa för att förskriva ett effektivt antibiotikum.

Teknikens begränsningar

Vissa bakterier kan vara gramvariabla eller grambestämda. Men även denna information kan vara användbar för att begränsa bakteriell identitet. Tekniken är mest pålitlig när kulturer är mindre än 24 timmar gamla. Även om det kan användas på buljongkulturer, är det bäst att centrifugera dem först. Den primära begränsningen av tekniken är att den ger felaktiga resultat om misstag görs i tekniken. Övning och skicklighet behövs för att ge ett tillförlitligt resultat. Dessutom kan ett smittämne inte vara bakteriellt. Eukaryota patogener fläckar gramnegativa. De flesta eukaryota celler utom svampar (inklusive jäst) klarar emellertid inte fast vid objektglaset under processen.

Gramfärgningsförfarande

material

• Kristallfiolett (primär fläck)
• Grams jod (mordant, för att fixa kristallviolett i cellväggen)
• Etanol eller aceton (avfärgningsmedel)
• Safranin (sekundär fläck eller försänkning)
• Vatten i en sprutflaska eller droppflaska
• Mikroskopglas
• Blandat mikroskop

Steg

1. Placera en liten droppe bakterieprov på en bild. Värm fix bakterierna på objektglaset genom att leda den genom lågan hos en Bunsen-brännare tre gånger. Att applicera för mycket värme eller för länge kan smälta bakteriecellväggarna, förvränga deras form och leda till ett felaktigt resultat. Om för lite värme appliceras, kommer bakterierna att tvätta bort objektglaset under färgning.
2. Använd en dropper för att applicera den primära fläcken (kristallviolett) på objektglaset och låt den sitta i 1 minut. Skölj försiktigt bilden med vatten högst 5 sekunder för att ta bort överflödigt fläck. Att skölja för länge kan ta bort för mycket färg, medan att inte skölja tillräckligt länge kan tillåta för mycket fläck kvar på gramnegativa celler.
3. Använd en dropper för att applicera Grams jod på objektglaset för att fixa kristallvioletten på cellväggen. Låt den sitta i 1 minut.
4. Skölj objektglaset med alkohol eller aceton cirka 3 sekunder, följt omedelbart med en mild sköljning med vatten. De gramnegativa cellerna förlorar färg, medan de gram-positiva cellerna förblir violetta eller blå. Men om avfärgningsmedlet är kvar för länge förlorar alla celler färg!
5. Applicera den sekundära fläcken, safranin, och låt den sitta i 1 minut. Skölj försiktigt med vatten högst 5 sekunder. De gramnegativa cellerna bör vara färgade röda eller rosa, medan de gram-positiva cellerna fortfarande visas lila eller blå.
6. Visa bilden med ett sammansatt mikroskop. En förstoring av 500x till 1000x kan behövas för att skilja cellform och arrangemang.

Exempel på Gram-Positiva och Gram-Negativa Patogener

Inte alla bakterier som identifierats med Gram-fläcken är associerade med sjukdomar, men några viktiga exempel inkluderar:

• Gram-positiva cocci (rund): Staphylococcus aureus
• Gramnegativa kockar: Neisseria meningitidis
• Gram-positiva baciller (stavar): Bacillus anthracis
• Gramnegativa baciller: Escherichia coli