Hur man gör 10X TBE elektroforesbuffert

TBE och TAE används som buffertar i molekylärbiologi, främst för elektrofores av nukleinsyror. Trisbuffertar används under något basiska pH-förhållanden, som för DNA-elektrofores, eftersom detta håller DNA-lösligt i lösningen och avprotoneras så att det dras till den positiva elektroden och migrerar genom en gel. EDTA är en ingrediens i lösningen eftersom detta vanliga kelaterande medel skyddar nukleinsyror från nedbrytning med enzymer. EDTA kelaterar tvåvärda katjoner som är kofaktorer för nukleaser som kan förorena provet. Eftersom magnesiumkatjonen är en kofaktor för DNA-polymeras och restriktionsenzymer hålls emellertid koncentrationen av EDTA avsiktligt låg (cirka 1 mM koncentration).

10X TBE elektrofores buffertmaterial

• 108 g Tris-bas [tris (hydroximetyl) aminometan]
• 55 g borsyra
• 7,5 g EDTA, dinatriumsalt
• Avjoniserat vatten

Förberedelse för 10X TBE elektroforesbuffert

1. Lös upp Tris, borsyra och EDTA i 800 ml avjoniserat vatten.
2. Späd bufferten till 1 L. Oupplösta vita klumpar kan fås att lösa upp genom att placera flaskan med lösning i ett varmt vattenbad. En magnetisk rörstång kan hjälpa till med processen.

Du behöver inte sterilisera lösningen. Även om nederbörd kan inträffa efter en tidsperiod är stamlösningen fortfarande användbar. Du kan justera pH med hjälp av en pH-mätare och droppvis tillsätta koncentrerad saltsyra (HCl). Det är bra att lagra TBE-buffert vid rumstemperatur, även om du kanske vill filtrera stamlösningen genom ett 0,22 mikron filter för att ta bort partikel som kan främja nederbörd.

10X TBE elektrofores buffertlagring

Förvara flaskan med 10X buffertlösning vid rumstemperatur. Kylning påskyndar nederbörden.

Använda 10X TBE elektroforesbuffert

Lösningen späds ut före användning. Späd 100 ml 10X lager till 1 liter med avjoniserat vatten.

5X TBE Lösningsrecept

Fördelen med 5X-lösningen är att det är mindre troligt att det fälls ut.

• 54 g Tris-bas (Trizma)
• 27,5 gram borsyra
• 20 ml 0,5 M EDTA-lösning
• Avjoniserat vatten

Förberedelse

1. Lös upp Tris-basen och borsyra i EDTA-lösningen.
2. Justera lösningens pH till 8,3 med koncentrerad HCl.
3. Späd lösningen med avjoniserat vatten för att skapa 1 liter 5X stamlösning. Lösningen kan också spädas till 1X eller 0,5X för elektrofores.

Om du använder en 5X eller 10X lagerlösning av misstag ger du dåliga resultat eftersom lika mycket värme kommer att genereras. Förutom att du ger dålig upplösning kan provet skadas.

0,5X TBA-buffertrecept

• 5X TBE lagerlösning
• Destillerat avjoniserat vatten

Förberedelse

Tillsätt 100 ml 5X TBE-lösning till 900 ml destillerat avjoniserat vatten. Blanda noga före användning.

begränsningar

Även om TBE och TAE är vanliga elektroforesbuffertar, finns det andra alternativ för ledande lösningar med låg molaritet, inklusive litiumboratbuffert och natriumboratbuffert. Problemet med TBE och TAE är att Tris-baserade buffertar begränsar det elektriska fältet som kan användas vid elektrofores eftersom för mycket laddning orsakar en språngstemperatur.